幹細胞：過去、現在和未來 (一)

抽象的

近年來，幹細胞治療已成為極具前景和前沿的科研課題。治療方法的發展引起了人們的極大期望。本文是一篇綜述，重點關注不同幹細胞的發現以及基於這些細胞的潛在療法。幹細胞的起源之後是受控干細胞培養和衍生的實驗室步驟。質量控制和畸胎瘤形成測定是評估所測試幹細胞特性的重要程序。推導方法和培養基的利用對於為受控分化設置適當的環境條件至關重要。在許多類型的干組織應用中，石墨烯支架的使用和基於細胞外囊泡的療法的潛力因其多功能性而需要引起注意。該綜述總結了乾細胞療法必須克服的挑戰才能在世界範圍內被接受。各種各樣的可能性使這種尖端療法成為現代醫學的轉折點，為無法治癒的疾病提供了希望。

幹細胞分類

幹細胞是人體的非特化細胞。它們能夠分化成生物體的任何細胞，並具有自我更新的能力。幹細胞存在於胚胎和成體細胞中。專業化有幾個步驟。每一步都會降低發育潛能，這意味著單能幹細胞無法分化成與多能幹細胞一樣多的細胞類型。本章將重點介紹幹細胞分類，以便讀者更容易理解後面的章節。

全能幹細胞能夠分裂和分化成整個生物體的細胞。全能性具有最高的分化潛能，允許細胞形成胚胎和胚胎外結構。全能細胞的一個例子是受精卵，它是在精子使卵子受精後形成的。這些細胞以後可以發育成三個胚層中的任何一個或形成胎盤。大約 4 天后，囊胚的內細胞團變成多能細胞。這種結構是多能細胞的來源。

多能幹細胞 (PSC) 形成所有胚層的細胞，但不形成胚外結構，例如胎盤。胚胎幹細胞 (ESC) 就是一個例子。ESC 來源於植入前胚胎的內細胞團。另一個例子是源自植入胚胎外胚層的誘導多能幹細胞 (iPSC)。它們的多能性是一個連續體，從完全多能細胞（如 ESC 和 iPSC）開始，到效力較低的代表——多能、寡能或單能細胞——結束。評估其活性和光譜的方法之一是畸胎瘤形成測定。iPSC 是由體細胞人工生成的，它們的功能與 PSC 類似。它們的培養和利用對於現在和未來的再生醫學來說是非常有前途的。

與 PSC 相比，多能幹細胞的分化範圍更窄，但它們可以專注於特定細胞譜系的離散細胞。一個例子是造血幹細胞，它可以發育成多種類型的血細胞。分化後，造血幹細胞變成寡能細胞。然後其分化能力僅限於其譜系的細胞。然而，一些多能細胞能夠轉化為不相關的細胞類型，這建議將它們命名為多能細胞。

寡能幹細胞可以分化成幾種細胞類型。骨髓幹細胞就是一個例子，它可以分裂成白細胞，但不能分裂成紅細胞。

單能幹細胞的特徵在於最窄的分化能力和反複分裂的特殊性質。它們的後一個特徵使它們成為再生醫學治療用途的有前途的候選者。這些細胞只能形成一種細胞類型，例如皮膚細胞。

幹細胞生物學

精子和卵子受精融合後形成囊胚。它的內壁排列著短命的干細胞，即胚胎幹細胞。囊胚由兩種不同的細胞類型組成：內細胞團 (ICM)，它發育成外胚層並誘導胎兒發育，以及滋養外胚層 (TE)。囊胚負責 ICM 微環境的調節。TE 繼續發育並形成胚胎成功起源所需的胚胎外支持結構，例如胎盤。隨著 TE 開始形成專門的支持結構，ICM 細胞保持未分化、完全多能和增殖. 幹細胞的多能性使它們能夠形成生物體的任何細胞。人類胚胎幹細胞 (hESC) 來源於 ICM。在胚胎髮生過程中，細胞形成稱為胚層的聚集體：內胚層、中胚層和外胚層，每一個最終都會產生胎兒的分化細胞和組織，以及後來的成體生物體 [ 2]. 在 hESCs 分化成一個胚層後，它們變成多能幹細胞，其效力僅限於胚層細胞。這個過程在人類發展中是短暫的。之後，多能幹細胞以未分化細胞的形式出現在整個生物體中，其關鍵能力是通過形成下一代幹細胞進行增殖，並在特定生理條件下分化為特化細胞。

影響幹細胞特化過程的信號可分為外部信號，如細胞之間的物理接觸或周圍組織的化學分泌，以及內部信號，即由 DNA 中的基因控制的信號。

幹細胞還充當身體的內部修復系統。只要有機體還活著，新細胞的補充和形成是無限的。幹細胞活性取決於它們所在的器官；例如，在骨髓中，它們的分裂是恆定的，儘管在胰腺等器官中，分裂只發生在特殊的生理條件下。

幹細胞功能分裂

全身發育

在分裂過程中，不同幹細胞的存在取決於生物體的發育。可以區分成體幹細胞ESC。雖然在不與 TE 分離的情況下推導 ESC 是可能的，但這種組合具有增長限制。因為增殖行為是有限的，所以通常避免這些的共培養。

胚胎幹細胞來源於囊胚的內細胞團，這是植入前胚胎的一個階段。受精後4天。之後，將這些細胞置於充滿培養基的培養皿中。傳代是一種低效但流行的將細胞傳代到其他培養皿的過程。這些細胞可以被描述為多能的，因為它們最終能夠分化成生物體中的每一種細胞類型。自他們的研究開始以來，就存在與 ESC 在治療中的醫學用途相關的倫理限制。大多數胚胎幹細胞是從在體外受精的卵子中發育而來的，而不是從體內受精的卵子中發育而來。

體細胞或成體幹細胞未分化，存在於發育後全身的分化細胞中。這些細胞的功能是使每天丟失的細胞能夠癒合、生長和更換。這些細胞的分化選擇範圍有限。在眾多類型中，有以下幾種：

• 間充質乾細胞存在於許多組織中。在骨髓中，這些細胞主要分化成骨、軟骨和脂肪細胞。作為乾細胞，它們是一個例外，因為它們具有多能性，可以專長於任何胚層的細胞。
• 神經細胞產生神經細胞及其支持細胞——少突膠質細胞和星形膠質細胞。
• 造血幹細胞形成各种血細胞：紅細胞、白細胞和血小板。
• 例如，皮膚幹細胞形成角質形成細胞，形成皮膚保護層。

成體幹細胞的增殖時間比胚胎幹細胞長。有可能將成體幹細胞重新編程回到它們的多能狀態。這可以通過將成體細胞核轉移到卵母細胞的細胞質中或通過與多能細胞融合來進行。在克隆著名的多利羊時使用了相同的技術。

hESCs 參與全身發育。它們可以分化為多能、全能、多能和單能細胞

如果多能細胞可以額外形成胚胎的胚外組織，則可以稱為全能細胞。多能細胞在分化為給定組織的每種細胞類型時受到限制。當組織僅包含一種細胞譜係時，形成它們的干細胞稱為寡聚或單能幹細胞。

iPSC 質量控制和形態差異識別

用於治療的 iPSC 系需要來自不同個體的干細胞系具有可比性 [ 3 ]。在關鍵質量程序中，可以區分以下內容：

短串聯重複分析——這是樣本 DNA 上特定位點的比較。它用於測量重複單元的確切數量。一個單元由在 DNA 鏈上重複多次的 2 到 13 個核苷酸組成。聚合酶鏈反應用於檢查短串聯重複序列的長度。建議對源組織、細胞、iPSC 種子和主細胞庫進行基因分型。

身份分析——細胞系的無意轉換會導致其他幹細胞系污染，需要嚴格的細胞系鑑定分析。

殘留載體測試——整合到宿主基因組中的重編程載體的出現是危險的，測試它們的存在是一個強制性程序。它是生成高質量 iPSC 線的常用程序。高質量研究級 iPSC 系集合中可接受的閾值是每 100 個細胞≤ 1 個質粒拷貝。在此過程中，應將所有質粒共有的 2 個不同區域用作特定目標，例如 EBNA 和 CAG 序列 . 為了準確地表示測試反應，需要在來自特徵良好的 hPSC 線的 gDNA 載體中製備標準曲線。為了計算每個細胞的質粒拷貝數，至關重要的是要納入內部參考 gDNA 序列，以便對例如核糖核酸酶 P (RNaseP) 或人端粒酶逆轉錄酶 (hTERT) 進行量化。

核型——hESCs 的長期培養可以積累培養驅動的突變 。因此，額外關注基因組完整性至關重要。核型測試可以通過復甦代表性等分試樣並在收穫細胞進行核型分析之前培養 48-72 小時來進行。如果在前 20 個核型中發現異常，則必須對新鮮樣本重複分析。當這種情況反復出現時，該線路被評估為異常。必須記錄重複的異常情況。儘管核型分析是乾細胞質量控制中的關鍵程序，但稍後討論的單核苷酸多態性 (SNP) 陣列的分辨率要高出大約 50 倍。

病毒檢測——評估幹細胞的質量時，必須進行所有有害人類外來因子的檢測（例如丙型肝炎或人類免疫缺陷病毒）。對於非無異種培養劑，必須執行此程序。

細菌學——細菌或真菌無菌試驗可分為基於培養物或肉湯的試驗。所有程序都必須由執行工作所在轄區的藥典推薦。

單核苷酸多態性陣列——該程序是一種 DNA 微陣列，通過檢測亞染色體變化和雜合性的拷貝中性丟失以及細胞轉化的指示來檢測群體多態性。SNP 檢測由三個部分組成。第一種是用熒光染料標記片段化的核酸序列。第二個是包含固定化等位基因特異性寡核苷酸 (ASO) 探針的陣列。最後一個組件檢測、記錄並最終解釋信號。

流式細胞術——這是一種利用光對異質液體混合物中的細胞進行計數和分析的技術。它使研究人員能夠準確、快速地從含有活細胞的異質液體混合物中收集數據。細胞一個一個地通過狹窄的通道。在光照期間，傳感器檢測從細胞發射或折射的光。最後一步是數據分析、編譯和整合，形成樣本的綜合圖。

表型多能性測定——識別未分化細胞對於成功的干細胞治療至關重要。除其他特徵外，幹細胞似乎具有獨特的形態，具有高核質比和突出的核仁。細胞看起來是扁平的，有明確的邊界，與分化的集落形成對比，後者表現為位置鬆散、邊界粗糙的細胞 . 重要的是，每個細胞系的理想和低質量菌落的圖像都保存在實驗室中，因此每當對培養質量有疑問時，始終可以根據代表性圖像進行檢查。必須進行胚狀體形成或單層培養的定向分化以產生代表所有三個胚胎胚層的細胞類型。值得注意的是，在不同條件下培養的菌落可能具有不同的形態 。

組蛋白修飾和 DNA 甲基化——質量控制可以通過使用組蛋白修飾或 DNA 甲基化等表觀遺傳分析工具來實現。當乾細胞分化時，甲基化過程會沉默多能性基因，從而降低分化潛能，儘管其他基因可能會經歷去甲基化以表達 。需要強調的是，幹細胞身份及其形態特徵也與其表觀遺傳特徵有關。根據 Brindley 的說法，表觀遺傳變化、多能性和細胞擴增條件之間存在關係，這強調未甲基化區域似乎是血清依賴性的。

hESC 推導和媒體

hESC 可以使用多種方法獲得，從經典培養到激光輔助方法或顯微外科手術 。必須指定 hESC 分化以避免畸胎瘤形成（見圖3）。

hESC 自發分化為胚胎體 (EB) 。可以研究 EB 而不是胚胎或動物，以預測它們對早期人類發育的影響。獲得 EB 的方法有很多種，例如生物反應器培養 、懸滴培養 或微孔技術。這些方法允許在體外形成特定的前體 。

這些培養程序的重要部分是分離內細胞團以培養未來的 hESC（圖4)。羅索夫斯基等人。 強調必須特別注意控制自發分化。當集落達到合適的大小時，必須分離細胞。多能細胞的出現持續 1-2 天。由於 hESCs 的經典利用引起了對手術過程中使用的原腸胚的倫理擔憂，Chung 等人。發現也可以從四個細胞胚胎中獲得 hESC，從而使胚胎存活的概率更高。此外，張等人。僅用於體外受精生長停滯的細胞。

細胞傳代用於在新的培養表面形成更小的細胞簇 [ 21 ]。有四個重要的傳代程序。

酶促解離是酶對結合菌落的蛋白質和粘附域的切割作用。這是一種比手動通道更溫和的方法。傳代後不要單獨留下 hESC 至關重要。孤立細胞更敏感，更容易發生細胞死亡；IV 型膠原酶就是一個例子[ 22、23 ]。

另一方面，手動通道側重於使用細胞划痕器。某些細胞的選擇不是必需的。這應該在細胞系衍生的早期階段完成 [ 24 ]。

胰蛋白酶利用可實現健康、自動化的 hESC 傳代。良好生產規範 (GMP) 級重組胰蛋白酶可廣泛用於該程序 [ 24 ]。然而，存在降低幹細胞的多能性和活力的風險 [ 25 ]。蛋白質 rho 相關蛋白激酶 (ROCK) 的抑製劑可以停止胰蛋白酶的利用 [ 26 ]。

乙二胺四乙酸( EDTA ) 通過螯合二價陽離子間接抑制細胞間連接。它們的抑制會促進細胞解離 [ 27 ]。

幹細胞需要生長因子和營養素的混合物才能分化和發育。培養基應每天更換。

用於 hESC 的傳統培養方法是小鼠胚胎成纖維細胞 (MEF) 作為飼養層和牛血清 [ 28 ] 作為培養基。馬丁等人。[ 29 ] 表明，在存在動物產品的情況下培養的 hESC 表達非人類唾液酸N -羥乙酰神經氨酸 (NeuGc)。飼養層通過白血病抑制因子 (LIF) 等因素防止不受控制的增殖 [ 30 ]。

第一層無飼養層培養可以補充血清替代物，結合層粘連蛋白 [ 31 ]。這導致幹細胞的穩定核型和持續一年以上的多能性。

初始培養基可以是血清（如胎牛血清 FCS）、人工替代品如合成血清替代品 (SSS)、基因敲除血清替代品 (KOSR) 或 StemPro [ 32 ]。最簡單的培養基僅包含八種必需元素：DMEM/F12 培養基、硒、NaHCO 3 、 L-抗壞血酸、轉鐵蛋白、胰島素、TGFβ1 和 FGF2 [ 33 ]。目前尚不完全清楚是否可以允許為 hESC 開發的培養系統無需適應 iPSC 培養。

幹細胞治療的轉折點

幹細胞療法的轉折點出現在 2006 年，當時科學家山中伸彌和高橋一敏發現可以將多能成體幹細胞重新編程為多能狀態。這個過程避免了危及胎兒生命的過程。逆轉錄病毒介導的小鼠成纖維細胞轉導具有四種主要在胚胎幹細胞中表達的轉錄因子（Oct-3/4、Sox2、KLF4 和 c-Myc）[ 34 ]，可誘導成纖維細胞成為多能細胞（圖 5） [ 35 ]。這種新形式的干細胞被命名為 iPSCs。一年後，該實驗在人體細胞上也取得了成功 [ 36]. 取得這一成功後，該方法開闢了乾細胞研究的新領域，產生了一代可定制且與患者生物相容的 iPSC 細胞系。最近，研究集中在減少致癌作用和改善傳導系統上。

轉折點受到 1962 年和 1987 年發生的先前發現的影響。

前一個發現是關於科學家 John Gurdon 通過將核從青蛙的體細胞轉移到卵母細胞中成功克隆青蛙。這導致體細胞發育完全逆轉 [ 37 ]。他的實驗結果成為一個巨大的發現，因為以前認為細胞分化只是單向的，但他的實驗表明相反，並證明體細胞甚至有可能再次獲得多能性 [ 38 ]。

後者是 Davis RL 的一項發現，專注於成纖維細胞 DNA 減法。發現了三個最初出現在成肌細胞中的基因。只有一種基因的強製表達，稱為肌原性分化 1 (Myod1)，導致成纖維細胞轉化為成肌細胞，表明重編程細胞是可能的，它甚至可以用於將細胞從一個譜系轉化為另一個譜系 [ 39 ] .

iPS細胞

雖然多能性只能在胚胎幹細胞中自然發生，但誘導終末分化細胞再次成為多能性是可能的。直接重新編程的過程將分化的體細胞轉化為可以形成生物體所有細胞類型的 iPSC 系。重編程側重於致癌基因的表達，例如 Myc 和 Klf4（Kruppel 樣因子 4）。下調促進基因組穩定性的基因（例如 p53）會增強該過程。此外，細胞重編程涉及組蛋白改變。所有這些過程都可能導致潛在的誘變風險，並隨後導致突變數量增加。昆蘭等。[ 40] 使用全基因組 DNA 測序和結構變異 (SV) 檢測算法檢查完全多能小鼠 iPSC。基於這些研究，證實雖然在非遺傳區域存在單一突變，但存在非逆轉錄轉座子插入。由此得出的結論是，當前的重編程方法可以在不發生嚴重基因組改變的情況下產生完全多能的 iPSC。

在從多能 hESC 到分化體細胞的發育過程中，這些細胞的表觀遺傳結構出現了重要的變化。與每種細胞類型相關的基因轉錄存在限製或許可。當使用轉錄因子對體細胞進行重新編程時，所有表觀遺傳結構都必須重新調節以獲得具有多能性的 iPSC [ 41 ]。然而，每個組織的細胞都會經歷特定的體細胞基因組甲基化。這會影響轉錄，從而進一步引起誘導多能性的改變 [ 42 ]。

iPSC 的來源

因為多能細胞可以無限繁殖並分化成任何類型的細胞，所以它們可以是無限的來源，用於替換丟失或患病的組織。iPSC 在幹細胞治療中繞過了對胚胎的需求。因為它們是由患者自身的細胞製成的，所以它們是自體的，不再產生任何免疫排斥的風險。

起初，成纖維細胞被用作 iPSC 的來源。因為需要活組織檢查來獲得這些類型的細胞，所以該技術進行了進一步的研究。研究人員調查了是否可以在該方法中使用更容易獲得的細胞。此外，該過程還使用了其他細胞：外周血細胞、角質形成細胞和尿液中發現的腎上皮細胞。幹細胞移植的另一種策略是刺激患者的內源性幹細胞分裂或分化，這在皮膚傷口癒合時自然發生。2008 年，胰腺外分泌細胞被重新編程為功能性、產生胰島素的 β 細胞 [ 43 ]。

最好的干細胞來源似乎是成纖維細胞，這在物流方面更具吸引力，因為它的刺激可以快速且更好地控制 [ 44 ]。

畸胎瘤形成試驗

iPSC 的自我更新和分化能力在再生醫學科學中引起了極大的興趣和關注。為了研究他們的能力，需要進行質量控制測定，其中最重要的一項是畸胎瘤形成測定。畸胎瘤是良性腫瘤。畸胎瘤能夠在體內快速生長，並且因其能夠同時發育成所有三個胚層的組織而具有特徵。由於畸胎瘤的高多能性，這種形成試驗被認為是對 iPSC 能力的評估 [ 45 ]。

例如，觀察到人類 iPSC 中的畸胎瘤形成率高於 hESC [ 46 ]。這種差異可能與不同的分化方法和細胞起源有關。最常見的是，畸胎瘤檢測涉及在免疫缺陷的小鼠皮下或睾丸或腎囊下注射經檢查的 iPSC [ 47 ]。注射後，可以觀察到未成熟但可識別的組織，例如腎小管、骨骼、軟骨或神經上皮 [ 30 ]。注射部位可能會影響畸胎瘤形成的效率 [ 48 ]。

此測定中使用三組標記來區分胚層細胞。對於內胚層組織，有胰島素/C 肽和 α-1 抗胰蛋白酶 [ 49 ]。對於中胚層，可以使用衍生物，例如用於骨的軟骨基質蛋白和用於軟骨的阿爾新藍。作為外胚層標記物，III B 類肉毒桿菌素或角蛋白可用於角質形成細胞。

畸胎瘤形成試驗被認為是證明人類 iPSC 多能性的黃金標準，證明了它們在生理條件下的可能性。由於它們的實際組織形成，它們可用於表徵許多細胞譜系 [ 50 ]。

定向微分

為了在治療中發揮作用，幹細胞必鬚根據需要轉化為所需的細胞類型，否則整個再生醫學過程將毫無意義。胚胎幹細胞的分化至關重要，因為未分化的胚胎幹細胞會在體內導致畸胎瘤形成。了解和使用信號通路進行分化是成功再生醫學的重要方法。在定向分化中，它可能會模擬細胞在經歷連續發育階段時接收到的信號 . 細胞外微環境在控制細胞行為中起著重要作用。通過操縱培養條件，可以限制特定的分化途徑，並在體外產生富含某些前體的培養物。然而，在體內實現類似的效果具有挑戰性。開發能夠促進 ESC 同質和增強分化為功能性和所需組織的培養條件至關重要。

關於胚胎幹細胞的自我更新，Hwang 等人。[ 52 ] 指出，基於 hESC 的細胞和組織治療的理想培養方法是一種不含飼養層或動物成分的特定培養物。這是因為細胞和組織治療需要維持大量未分化的 hESC，這使得飼養細胞不適合此類任務。

大多數定向分化方案的形成是為了模擬原腸胚形成過程中內細胞團的發育。在此過程中，多能幹細胞分化為外胚層、中胚層或內胚層祖細胞。Mall 分子或生長因子誘導幹細胞轉化為合適的祖細胞，這些祖細胞隨後會產生所需的細胞類型。有多種信號強度和分子家族可能影響體內胚層的建立，例如成纖維細胞生長因子 (FGF) [ 53 ]；Wnt 家族 [ 54 ] 或轉化生長因子超家族——β(TGFβ)；和骨形態發生蛋白 (BMP) [ 55]. 每個候選因子必須在不同的濃度下進行測試，並另外應用於不同的持續時間，因為胚胎髮育細胞在分化過程中受到影響的精確濃度和時間是未知的。例如，內源性 BMP 和 Wnt 信號的分子拮抗劑可用於外胚層的 ESC 形成 [ 56 ]。然而，短暫的 Wnt 和較低濃度的 TGFβ 家族會觸發中胚層分化 [ 57 ]。關於內胚層形成，可能需要更高的激活素 A 濃度[ 58、59 ]。

關於形成每個胚層細胞祖細胞的方法有很多方案，例如心肌細胞[ 60 ]、肝細胞[ 61 ]、腎細胞[ 62 ]、肺細胞[ 63、64 ] 、運動神經元[ 65 ]、腸細胞 [ 66 ] 或軟骨細胞 [ 67 ]。

將 iPSC 或 ESC 定向分化為例如肝細胞，可能會影響和發展人類肝臟發育中分子機制的研究。此外，它還可以為形成外源性肝細胞進行藥物毒性試驗提供可能[ 68 ]。

特定信號分子的濃度水平和作用持續時間可引起多種因素。不幸的是，就目前而言，重組因子的高成本可能會限制它們在醫學上的更大規模使用。更有前途的技術側重於小分子的使用。這些可用於激活或停用特定信號通路。它們通過創建與所需組織類型相容的細胞來提高重編程效率。這是一種更便宜且無免疫原性的方法。

小分子細胞療法的成功例子之一是 Hedgehog 通路的拮抗劑和激動劑。它們顯示在運動神經元再生中非常有用 [ 69 ]。具有胚胎髮育功能的內源性小分子也可用於體外誘導細胞分化；例如，當實驗室程序涉及 hESC 時，負責在體內形成神經系統 [ 70 ] 的視黃酸會令人驚訝地誘導視網膜細胞形成 [ 71 ]。

分化因子的功效取決於功能成熟度、效率，最後，將產生的細胞引入其體內等效物。地形、剪切應力和基質剛度是影響未來細胞表型的因素 [ 72 ]。

生物物理和生化信號的控制、生物物理環境和 hESC 分化的正確引導是適當培養幹細胞的重要因素。

幹細胞利用及其製造標準和培養系統

歐洲藥品管理局和食品和藥物管理局已經制定了安全和適當的干細胞移植的良好生產規範 (GMP) 指南。過去，用於乾細胞移植的方案需要動物衍生產品 [ 73 ]。

引入動物抗原或病原體的風險導致其使用受到限制。由於這些限制，該技術需要明顯更新 [ 74 ]。現在，在建立源自新鮮胚胎和從人類飼養細胞系培養的細胞係時，必須使用無異源等同物 [ 75 ]。在這種方法中，用不含異種物質的等效物替換任何非人類材料至關重要 [ 76 ]。

帶有 LN-511 的 NutriStem、帶有人重組層粘連蛋白 (LN-511) 的 TeSR2 和帶有人包皮成纖維細胞 (HFF) 的 RegES 是常用的無異種培養系統 [ 33 ]。有許多組織和國際倡議，例如國家幹細胞銀行，提供用於治療或醫學研究的干細胞系 [ 77 ]。

幹細胞在醫學上的應用

幹細胞具有成為醫學最重要方面之一的巨大潛力。除了他們在開發恢復醫學方面發揮重要作用這一事實外，他們的研究還揭示了有關人類發展過程中發生的複雜事件的大量信息。

幹細胞和分化細胞之間的差異反映在細胞的 DNA 中。在前一個細胞中，DNA 與工作基因鬆散排列。當信號進入細胞並開始分化過程時，不再需要的基因被關閉，但特殊功能所需的基因將保持活躍。這個過程可以逆轉，並且已知這種多能性可以通過基因序列中的相互作用來實現。Takahashi 和 Yamanaka [ 78 ] 以及 Loh 等人。[ 79 ] 發現八聚體結合轉錄因子 3 和 4 (Oct3/4)、性別決定區 Y (SRY)-box 2 和 Nanog 基因作為維持多能性的核心轉錄因子發揮作用。其中，Oct3/4 和 Sox2 對於 iPSC 的生成至關重要。

許多嚴重的疾病，如先天缺陷或癌症，都是由不當的分化或細胞分裂引起的。目前，有幾種干細胞療法是可行的，其中包括治療脊髓損傷、心力衰竭 [ 80 ]、視網膜和黃斑變性 [ 81 ]、肌腱斷裂和 1 型糖尿病 [ 82 ]。幹細胞研究可以進一步幫助更好地理解幹細胞生理學。這可能會導致找到治療目前無法治癒的疾病的新方法。

造血幹細胞移植

造血幹細胞很重要，因為它們是迄今為止表徵最徹底的組織特異性幹細胞；畢竟，它們已經經過 50 多年的實驗研究。這些幹細胞似乎為研究組織特異性幹細胞提供了一個準確的範例模型系統，並且它們在再生醫學中具有潛力。

多能造血幹細胞（HSC）移植是目前最流行的干細胞療法。靶細胞通常來源於骨髓、外周血或臍帶血 [ 83 ]]. 該程序可以是自體的（當使用患者自己的細胞時）、同種異體的（當乾細胞來自捐贈者時）或同基因的（來自同卵雙胞胎）。HSC 負責生成血液中所有功能性造血譜系，包括紅細胞、白細胞和血小板。HSC 移植解決了由造血系統功能異常引起的問題，包括白血病和貧血等疾病。然而，當考慮到 HSC 的傳統來源時，存在一些重要的限制。首先，可移植細胞的數量有限，而且尚未找到一種有效的收集方法。尋找合適的抗原匹配供體進行移植也存在問題，病毒污染或任何免疫反應也會導致傳統 HSC 移植效率降低。造血移植應保留給患有危及生命的疾病的患者，因為它具有多因素特徵並且可能是危險的程序。iPSC 的使用在此過程中至關重要。使用患者自身的非特化體細胞作為乾細胞可提供最大的免疫相容性並顯著提高手術的成功率。

幹細胞作為藥理學測試的靶標

幹細胞可用於新藥試驗。活體組織的每個實驗都可以在多能細胞的特定分化細胞上安全地進行。如果出現任何不良影響，可以更改藥物配方，直到達到足夠的有效性水平。該藥物可以在不傷害任何活體測試者的情況下進入藥理市場。然而，為了正確地測試藥物，在比較兩種藥物的作用時，條件必須相同。為了實現這一目標，研究人員需要完全控制分化過程以生成純的分化細胞群。

幹細胞作為關節成形術的替代品

職業運動員最大的恐懼之一就是受傷，這通常意味著他們職業生涯的結束。這尤其適用於肌腱損傷，由於目前的治療選擇側重於保守治療或手術治療，因此往往無法提供可接受的結果。肌腱的問題始於它們的再生能力。肌腱不會在受傷後進行功能再生，而只是通過形成缺乏健康組織功能的疤痕組織來癒合。可能導致這種失敗的癒合反應的因素包括血管過多、鈣化物質沉積、疼痛或腫脹 。

此外，除了肌腱問題外，很可能會出現稱為骨關節炎 (OA) 的關節病理狀況 [ 85 ]。由於關節軟骨的無血管特性及其低再生能力，OA 很常見 [ 86 ]。雖然關節成形術目前是治療 OA 的常見手術，但對於年輕患者來說並不理想，因為他們的壽命可能比植入物長，並且將來需要多次手術。在這些情況下，幹細胞療法可以通過阻止 OA 的發作來提供幫助 [ 87 ]。然而，這些程序並不完善，透明軟骨的長期維持需要進一步研究。

股骨髖骨壞死 (ONFH) 是一種難治性疾病，與股骨頭塌陷和年輕人群進行髖關節置換術的風險相關 [ 88 ]。儘管全髖關節置換術 (THA) 在臨床上取得了成功，但對於年輕患者來說並不理想，這主要是由於假體的使用壽命有限。越來越多的臨床研究評估了乾細胞對 ONFH 的治療效果。大多數作者都證明了積極的結果，疼痛減輕、功能改善或避免了THA [ 89、90、91 ]。

通過細胞編程復興

衰老是一個可逆的表觀遺傳過程。第一項細胞再生研究發表於 2011 年 [ 92 ]。與年輕細胞相比，來自老年個體的細胞具有不同的轉錄特徵、高水平的氧化應激、功能失調的線粒體和更短的端粒 [ 93 ]。有一種假設認為，當人類或小鼠成體體細胞被重新編程為 iPSC 時，它們的表觀遺傳年齡實際上被重置為零 [ 94 ]。這是基於表觀遺傳模型，該模型解釋了在受精時，所有腸外衰老的標記都從受精卵的基因組中刪除，其衰老時鐘被重置為零 [ 95 ]。

在他們的研究中，Ocampo 等人。[ 96 ] 使用 Oct4、Sox2、Klf4 和 C-myc 基因（OSKM 基因）並影響再生能力差的胰腺和骨骼肌細胞。他們的程序表明，這些基因也可用於有效的再生治療 [ 97 ]。他們方法的主要挑戰是需要採用一種不使用轉基因動物且不需要無限期長期應用的方法。第一種臨床方法是預防性的，側重於停止或減緩衰老速度。之後，可以嘗試對老年人進行漸進式複興。將來，這種方法可能會引發一些倫理問題，例如人口過剩，導致食物和能源的可用性降低。

目前，重要的是了解如何在非轉基因老年動物和人類中實施細胞重編程技術，以在不去除細胞身份的表觀遺傳標記的情況下消除衰老痕跡。

基於細胞的療法

可以誘導幹細胞成為修復受損或破壞組織所需的特定細胞類型（圖 6）。目前，當對可移植組織和器官的需求超過可能的供應時，幹細胞似乎是解決該問題的完美方法。受益於此類治療的最常見病症是黃斑變性 [ 98 ]、中風 [ 99 ]、骨關節炎 [ 89、90 ] 、神經退行性疾​​病和糖尿病 [ 100 ]。由於這項技術，有可能產生健康的心肌細胞，然後將它們移植到心髒病患者身上。

在 1 型糖尿病的情況下，胰腺中產生胰島素的細胞由於自身免疫反應而被破壞。作為移植療法的替代方法，可以誘導幹細胞分化為胰島素生成細胞 。

幹細胞和組織庫

iPS 細胞具有理論上無限的繁殖和分化能力，對現在和未來的科學都具有吸引力。它們可以儲存在組織庫中，成為用於醫學檢查的人體組織的重要來源。實驗室中保存的常規分化組織細胞的問題是它們的繁殖特徵會隨著時間的推移而減弱。這不會發生在 iPSC 中。

眾所周知，臍帶富含間充質乾細胞。由於其在出生後立即進行冷凍保存，其乾細胞可以成功儲存並用於治療，以預防給定患者未來患上危及生命的疾病。

在脫落的乳牙中發現的人類脫落的乳牙 (SHED) 幹細胞比其他幹細胞具有發育成更多類型身體組織的能力 。它們的收集、分離和存儲技術簡單且無創。SHED 電池的優點包括：

• 保證供體匹配的自體移植，不會引起免疫反應和細胞排斥
• 對孩子和父母來說簡單無痛
• 不到臍帶血儲存成本的三分之一
• 不受與胚胎幹細胞相同的倫理問題的影響
• 與臍帶血幹細胞相比，SHED 細胞能夠再生為實體組織，例如結締組織、神經組織、牙齒組織或骨組織
• SHED 對捐贈者的近親很有用

生育疾病

2011 年，兩位研究人員 Katsuhiko Hayashi 等人。[ 107 ]，在小鼠實驗中表明，可以從 iPSC 形成精子。他們成功地在不育小鼠中產下了健康且能生育的幼崽。該實驗在雌性小鼠身上也取得了成功，其中 iPSC 形成了功能齊全的卵子。

有失去精原幹細胞 (SSC) 風險的年輕人，主要是癌症患者，是可以受益於睾丸組織冷凍保存和自體移植的主要目標群體。成人和青春期前睾丸組織的有效冷凍方法是可用的 [ 108 ]。

秋萬等。[ 109 ]提供了重要證據表明人羊膜上皮細胞（hAEC）移植可以通過抑制細胞凋亡和減輕小鼠受損卵巢組織的炎症來有效改善卵巢功能，並且它可能是治療卵巢早衰或功能不全的有前途的策略在女性癌症倖存者中。

目前，成功治療人類不孕症似乎只是時間問題，但仍有幾個挑戰需要克服。第一，工藝要有高效率；其次，必須最大限度地減少形成腫瘤而不是卵子或精子的機會。最後一個障礙是如何在實驗室中成熟人類精子和卵子而不將它們移植到體內條件下，這可能導致腫瘤風險或侵入性手術。

治療無法治癒的神經退行性疾​​病

得益於乾細胞療法，不僅可以延緩帕金森病、阿爾茨海默病 (AD) 和亨廷頓舞蹈病等無法治癒的神經退行性疾​​病的進展，最重要的是，還可以消除問題的根源。在神經科學中，神經乾細胞 (NSC) 的發現推翻了之前認為成人 CNS 不能進行神經發生的觀點 [ 110 , 111 ]。神經乾細胞能夠改善 AD 臨床前囓齒動物模型的認知功能 [ 112 , 113 , 114 ]。敬畏等。[ 115] 從皮膚打孔活組織檢查中臨床衍生的相關人類 iPSC，以開發一種基於神經乾細胞的治療 AD 的方法。帕金森病 (PD) 中的神經元變性是局灶性的，並且可以從 hESC 中有效地生成多巴胺能神經元。PD 是基於 iPSC 的細胞治療的理想疾病 [ 116 ]。然而，這種療法仍處於實驗階段（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4539501/）。來自流產胎兒的腦組織被用於治療帕金森病患者 [ 117 ]。儘管結果並不統一，但它們表明純乾細胞療法是一種重要且可實現的療法。

幹細胞在牙科中的應用

牙齒是再生醫學中極具挑戰性的材料。由於其複雜的結構，它們在發音、咀嚼或美學等方面的功能難以重建。目前，幹細胞有可能比合成材料得到更廣泛的應用。牙齒有一個很大的優勢，那就是它是最天然和非侵入性的干細胞來源。

目前，在不使用乾細胞的情況下，最常見的牙周病治療方法是生長因子、移植物或手術。例如，牙周膜中存在幹細胞 [ 118 , 119 ]，它們能夠分化成成骨細胞或成牙骨質細胞，其功能也在神經細胞中得到評估 [ 120 ]。組織工程是治療牙周病的成功方法。根尖區的干細胞能夠重建牙周膜。牙周病學中組織工程的一種可能方法是使用含有腺病毒的生長因子進行基因治療 [ 121 ]。

作為動物研究的結果，牙本質再生是導致牙本質橋形成的有效過程 [ 122 ]。

牙釉質比牙本質更難再生。成釉細胞瘤細胞分化成牙釉質後，前者被破壞，無法修復。醫學研究已成功將骨髓幹細胞分化為成釉細胞瘤 [ 123 ]。

健康的牙齒組織含有大量的常規幹細胞，但當組織受到創傷或發炎時，該數量會減少 [ 124 ]。有幾個可以分離的牙科幹細胞群（圖 7）。